蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质搬运到膜上，然后运用抗体进行细心的检测的办法。一个基因表达终极成果是产生相应的蛋白质(或酶)。因而检测蛋白质是测定基因表达的首要标志，检测蛋白质的办法许多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相相似的吸印办法。

  与Southern或Northern杂交办法相似，但Western Blot选用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用符号的二抗。

  通过PAGE别离的蛋白质样品，搬运到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键方式吸附蛋白质，且能坚持电泳别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素符号的第二抗体起反响，通过底物显色或放射自显影以检测电泳别离的特异性意图基因表达的蛋白成分。该技能也大范围的应用于检测蛋白水平的表达。

  3、仪器、耗材：电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、硝酸纤维素膜、匀浆器、剪刀、移液枪、刮棒

  (1) 倒掉培育液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培育液(或将瓶直立放置一瞬间使剩下培育液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

  (2) 每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放悄悄摇摆1 min洗刷细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培育液。将PBS弃净后把培育瓶置于冰上。

  (3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

  (4) 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充沛裂解培育瓶要常常来回摇摆。

  (5)裂解完后，用洁净的刮棒将细胞刮于培育瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

  (7) 将离心后的上清分装搬运倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

  (1)将少数安排块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用洁净的剪刀将安排块尽量剪碎。

  (2) 加400 μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。

  (4) 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20℃保存。

  因为受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应搜集培育液中的细胞。以下是培育液中细胞总蛋白的提取：

  (2)弃上清，参加4 ml PBS并用枪悄悄吹打洗刷，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗刷一次。

  (3)用枪洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30 min，裂解进程中要常常弹一弹以使细胞充沛裂解。

  (4)将裂解液与培育瓶中裂解液混在一同4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-20℃保存。

  (1)取足量的1.5 ml离心管，每管参加4℃贮存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。

  (2) 取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好规范曲线的程序下按blank测空白样品。

  (3)弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 mL)，再用无菌水洗一次。

  留意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可一同混合好多个样品再一同测，这样对测定许多的蛋白样品可节约许多时刻。测得的成果是5 ml样品含的蛋白量。

  一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉悄悄擦拭。双面都擦拭过后用自来水冲，再用蒸馏水冲刷洁净后立在筐里晒干。

  (1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后笔直卡在架子上预备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，防止漏胶。)

  (2)按前面办法配10%别离胶，参加TEMED后当即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪汲取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开端可快一些，胶面快到所需高度时要怠慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，不然胶会被冲变型。)

  (3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充沛凝结就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

  (4)按前面办法配4%的浓缩胶,参加TEMED后当即摇匀即可灌胶。将剩下空间灌满浓缩胶然后将梳子刺进浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下防止胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子坚持水平。因为胶凝结时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝结的进程中要常常在两头补胶。待到浓缩胶凝结后，两手别离捏住梳子的两头竖直向上悄悄将其拔出。

  (5)用水冲刷一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)

  (6)测完蛋白含量后，核算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml离心管中，参加5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超越15 μl，加样孔的最大极限可加20 μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。

  (7) 加满足的电泳液后开端预备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁汲取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢参加样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。参加下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗刷3次，防止穿插污染。

  电泳时刻一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可停止电泳，进行转膜。

  1. 转一张膜需预备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可运用。(用镊子捏住膜的一边悄悄置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只要基层才与水触摸。这样因为毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间构成一层空气膜，这样会阻挠膜吸水。

  2. 在加有搬运液的珐琅盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

  3. 将夹子翻开使黑的一面坚持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走值勤的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随意移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一同在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去诛求无厌的气泡。

  4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时分动作要轻，要在两个边上悄悄的重复撬。撬一瞬间玻璃板便开端松动，直到撬去玻板。(撬时一定要当心，玻板很易裂。)除掉小玻璃板后，将浓缩胶悄悄刮去(浓缩胶影响操作)，要防止把别离胶刮破。当心剥下别离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，悄悄用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不行再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除掉气泡。最终盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在搬运液中进行，要不断的擀去气泡。膜两头的滤纸不能彼此触摸，触摸后会产生短路。(搬运液含甲醇，操作时要戴手套，试验室要开门以使空气流通。)

  5. 将夹子放入搬运槽槽中，要使夹的黑面临槽的黑面，夹的白面临槽的红面。电搬运时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V搬运2 h或40 V搬运3 h。

  6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲刷掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晒干备用。

  1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有关闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇摆关闭1h。

  2. 将一抗用TBST稀释至恰当浓度(在1.5 ml离心管中);撕下恰当巨细的一块儿保鲜膜铺于试验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜坚持平坦;将抗体溶液加到保鲜膜上;从关闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min。

  3. 同上办法预备二抗稀释液并与膜触摸，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反响。

  1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充沛触摸;1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

  2. 在暗室中，将1×显影液和定影液别离到入塑料盘中;在红灯下取出X-光片，用切纸刀取舍恰当巨细(比膜的长和宽均需大1 cm);翻开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开端计时;依据信号的强弱恰当调整曝光时刻，一般为1 min或5 min，也可选不一样时刻屡次压片，以达最佳作用;曝光完成后，翻开X-光片夹，取出X-光片，敏捷浸入显影液中显影，待呈现十分显着条带后，立刻停止显影。显影时刻一般为1～2 min(20～25℃)，温度过低时(低于16℃)需恰当延伸显影时刻;显影完毕后，立刻把X-光片浸入定影液中，定影时刻一般为5～10 min，以胶片通明停止;用自来水冲去残留的定影液后，室温下晒干。

  应留意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，不然会对成果产生影响。

  将胶片进行扫描或摄影，用凝胶图象处理系统剖析方针带的分子量和净光密度值。

  武汉视界学术渠道关于WB条带辨认、剖析成果等处理进程，只需要简简单单的一步:首要：百度查找 武汉视界学术渠道1、翻开视界学术网站，注册及登陆；2、进入工作台；